[황색포도상구균 정성실험 ]

안녕하세요 나칠라 입니다.
오늘은 황색포도상구균 실험방법에 대해서 설명해 드리도록 하겠습니다.

황포설명은 👇
https://bboudda.tistory.com/m/9

진짜 이 실험은... 준비과정이 너무 손이 많이 가서ㅜㅜ 황포실험은 STX(3M) 사용하는 것을 추천...ㅎ

식품공전

실험순서

• 첫 번째: 증균배양

1. TSB 증균배양배지 만들기
2. 25g/ml 샘플 준비
3. 40-50°C TSB배지액 전처리
4. 35+-2°C 24H 배양

• 두 번째: 분리배양

1. BPA배지 미리 만들어놓기(하루 전-10일 전)
2. BPA배지에 전처리한 샘플 스트레킹
3. 35+-2°C 24H 배양

(검은색 집락 확인)

• 확인시험

1. 검은색 집락환이 나오면

준비물

증균배양 전처리 용액 ▶증류수 ▶TSB배지 ▶메디아병 ▶NaCl

분리배양 배지만들기 ▶증류수 ▶BPA배지 ▶메디아병 ▶에그요크(에그에멀젼) ▶25ml용 피펫 ▶백금이

확인시험

 

증균배양 (1. 배양 액체 배지 만들기)

사용제품: (머크) TSB배지

배지통에 적혀있는 상세설명 문구.
실험자 중에 ○○g , 1L 기준 121°C 15 min  오토 클레이브
만 읽는 분 들이 계시더라고요!!

그러면 안 됩니다!
PDA 편에서도 뒤에 더 읽어보니 "10% 주석산을 넣어라"라고 되어 있었잖아요??ㅎ

이번에 제가 사용한 머크사 제품에는 이미 배지가루에
1L당 5g량의 NaCl함량이 되어있거든요.

실험실에서 사용되는 배지의 보관, 준비 및 구성에 관한 지침을 포함.

제가 해석을 하자면, (파파고 돌려도 제대로 안 나옴)

- 배지 보관: 배지는 건조하고 잘 밀봉된 곳에 보관해야 합니다. 뭉치거나 변색된 배지는 사용하지 마세요. 직사광선으로부터 멀리 두세요. 오직 실험실 사용을 위한 것입니다.

- 캐나다 내 구매처: Sigma-Aldrich Canada Co. 또는 Millipore (Canada) Ltd., 온타리오, L6H 6J8. 전화: +1800-565-1400.

- 준비 방법: 1리터의 탈이온수에 30.0g을 녹이고 오토클레이브 처리합니다 (15분). pH는 25℃에서 7.3±0.2.

- 전형적인 구성 (g/리터): 케이신에서 추출한 펩톤 17.0; 대두박에서 추출한 펩톤 12.0; 글루코스 2.6; 나트륨 염화물 5.0; 디-칼륨 수소 인산염 2.5.

여기서 문제!

나칠라는 실험을 하기 위해 500ml TSB배지를 사용하기 위해 NaCl을 얼마큼 넣어야 되는가?

정답을 구하셨나요?

47.5g

풀이:  500mL의 TSB 배지를 10% NaCl 농도 구하기

- 1리터(1000mL)의 배지에 10% NaCl을 첨가하기 위해서는 총 100g의 NaCl이 필요합니다.

- 이미 TSB 배지에 포함된 NaCl은 1리터당 5g입니다.

- 따라서 추가로 필요한 NaCl의 양은 95g (100g - 5g)입니다.

- 500mL 배지를 만들기 위해 이 양의 절반을 사용하면 됩니다.
= 95/2

그러므로 500mL의 TSB 배지에는 약 47.5g

전처리배지 만들기

NaCl준비

열심히 녹이기

121°C 15m 오토클레이브

전처리

시료 25g

TSB 225ml (25+225)

2분간 균질하기

전 혹시몰라서 전처리 용액 남은거 대조군으로 사용할려고 배양했어요!

1차 증균배양

*배양 온도*: 35-37 / *배양 시간*: 18-24시간

*배양 온도*: 35-37 / *배양 시간*: 18-24시간

배지 만들기(분리배양 용 BPA 만들기)

1.  배지가루 채취 (63g/1L)

 2. 121°C  15 min 오토클레이브.
3. 40°C 정도 식힌 후, tellurite첨가.

옥소이드용 텔루라이트

피펫휠러 사용

사용방법 설명:
https://bboudda.tistory.com/m/10

4. 이후 굳기 전에 얼른 배지에 붓고 굳히기.

5.  뒤로 뒤집어서 냉장보관(2주 정도 보관 가능)

제조일 꼭 써주기! / 은박지로 꼼꼼하게!

만드는 과정 동영상 첨부

알콜 소독 후, 클린벤치들어간 물건들 입니다.

2차 분리배양

1. 샘플 및 준비물 준비. (샘플, 백금이, 배지)

백금이, BPA배지 준비 완

2. 백금으로 시료 채취

백금이를 통해, 시료액을 뭍혀준다.

동그란 원안에 샘플액이 뭍을 정도는 너무 많은 양이다.

때문에 살짝 톡 털어준다.

3. 접종

🎈정균 배양액을 여러 한천배지
(난황첨가 만니톨 식염한천배지, Baird-Parker 한천배지, 또는 Baird-Parker(RPF) 한천배지)에 접종.

접종방법- 스트레킹 기법.

차이점
스트레킹(streaking) = 획선도말법
배지 표면에서 미생물 군집을 분리하기 위해 백금 이를 이용하여 한천 배지 표면에 미생물을 획선으로 도말하는 방법.

수프레딩(spreading) =  평판도말법
고체배지 표면에 미생물을 도말한 다음 배양.

밑에 사진은 평판도말법.

출처: 네이버 지식백과

4. 배양-35-37°C에서 18-24시간 동안 배양


5. 결과- 특정한 색상과 집락 형태를 통해 균의 성장을 관찰.

출처: MBCELL

🎈난황첨가 만니톨
황색 불투명한 집락, 주변에 혼탁한 집락

🎈🎈BPA
투명한 띠로 둘러싸져 있는 검은색 집락

🎈🎈🎈RPF
불투명한 환으로 둘러싸져 있는 검은색 집락

결과처럼 의심집락이 보이면 확인시험으로 넘어갑니다.

확인시험

⚠️사실 저도 확인시험까지는 한 번도 안 해봐서,
전공책, 블로그, 논문등을 보고 아주 간단하고
이해하기 쉽게 작성합니다!

황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 확인시험에서 검은색 집락이 발견되었을 때 (식품공전)


1. 시료 전처리 및 배양
   - 분리배양된 평판배지상의 집락을 한천배지 또는 Tryptic Soy 한천배지에 이식 후 35~37°C에서 18~24시간 동안 배양.

2. 그람 염색 수행
   - 배양된 세균을 추출하여 그람 염색을 시행합니다.
   - 그람 양성 결과가 확인되면, 포도상의 배열을 갖는 그람 양성 구균으로 확인합니다.
(B.P.F 섭틀리먼트 사용 배지는 coagulase 생략⭕️)

출처: MBcell

3. Coagulase 시험
   - 그람 양성 구균 중에서 응고 특성을 확인하기 위해 coagulase 시험을 시행합니다.
   - 24시간 이내에 응고 여부를 판정하여 황색포도상구균의 존재 여부를 확인합니다.

Coagulase 시험은 세균의 응고능력을 확인하는 실험으로, 주로 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 정성 확인 시에 사용됩니다.

이 실험을 통해 세균이 혈액 응고화 작용을 나타내는지 여부를 평가합니다.

Coagulase 시험 절차

1. Coagulase 양성 세균 준비
   - 이미 배양된 황색포도상구균 세균 콜로니를 선택하여 시험에 사용될 시료를 준비합니다.
(백금 이를 통해 하나를 톡 떼어주세요)

2. 시료 배지에 전파
   - Coagulase 시험 배지 (일반적으로 Rabbit Plasma Fibrinogen Agar)에 세균 시료를 전파합니다. 이 배지에는 응고를 촉진하는 성분이 함유되어 있습니다.

3. 배양 조건 설정
   - 전파된 시료를 특정 온도에서 (보통 35~37°C) 일정 기간 동안 배양합니다.

4. 응고 확인
   - 일정 기간 후, 시료 주위에서 응고 현상을 확인합니다. 응고는 시료 주위에서 응고 원이 형성되는 것으로 나타납니다.

5. 결과 해석:
   - 응고 양성: 시료 주위에서 응고 원이 관찰되면 Coagulase 양성으로 판정합니다. 이는 황색포도상구균의 특성 중 하나로 간주됩니다.

   - 응고 음성: 응고 현상이 나타나지 않으면 Coagulase 음성으로 판정합니다.

Coagulase 양성은 황색포도상구균의 식중독성에 연관된 특성 중 하나로, 이를 통해 세균의 정성을 확인할 수 있습니다.

4. Coagulase 양성 생화학 시험
   - Coagulase 양성으로 확인된 경우, 추가적으로 생화학적 시험을 실시하여 특성을 더 자세히 확인합니다.
   - 특정 특성이나 활성을 더 신속하게 평가하기 위해 생화학 시험을 수행합니다.

이러한 절차를 통해 정성 확인시험을 완료하게 되며, 황색포도상구균의 존재 여부와 특성을 신속하게 확인할 수 있습니다.

글로는 솔직히 이해하기 힘들 거 같습니다ㅠㅠ
기회 되면 꼭 확인시험을 해보고 싶긴 합니다:)