▶배지 및 사용시약 구매 분말배지- Difco, Merk, 옥소이드, 네오젠 등등 (저는 Difco 사용 중) 그 외 시약- 삼전(NaCl), 대정(글리세롤)
검체 채취
검체 채취 기구는 오토클레이브를 이용하여 멸균 후 건조 멸균한 기구는 화염멸균 실시 (검체 한 건마다 바꾸어 가며 사용) 불균질 한 검체= 다양한 부위에서 채취 균질한 검체= 어느 부분을 채취하여도 무방
식품공전 8.4.3 참조 미생물 검사용 시료는 25g 원칙 ( 시료량이 적을 경우 그 이하도 가능) 채취한 검체는 희석액을 이용하여 10,100,1000배등 단계별 희석용액 제조 가능 희석액은 멸균생리 식염수, 멸균 인산완충액 사용가능
배지 및 시험용액 제조
삼각 플라스크 준비 및 배지 계랑
증류수 준비 (매스실린더로 계량하여 배지와 증류수 혼합)
삼각플라스크 윗부분 알루미늄 포일을 이용하여 덮어주기
멸균 테이프 붙여주고, 오토클레이브 이용(멸균작업)
멸균 후, 40℃ 항온수조 or 50℃ 건조오븐에 넣어 배지 보관
참고사진
참고사진
참고사진
실험방법 (일반세균)
4.5.1 일반세균수
가. 표준평판법 표준한천배지에 검체를 혼합 응고시켜 배양 후 발생한 세균 집락수를 계수하여 검체 중의 생균 수를 산출하는 방법이다. 1) 시험조작 4.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 10배 단계 희석액 1 mL씩을 멸균 페트리접시 2매 이상 씩에 무균적으로 취하여 약 43～45°C로 유지한 표준한천배지(배지 1) 약 15 mL를 무균적으 로 분주하고 페트리접시 뚜껑에 부착하지 않도록 주의하면서 조용히 회전하여 좌우로 기울이 면서 검체와 배지를 잘 혼합하여 응고시킨다. 확산집락의 발생을 억제하기 위하여 다시 표준한천배지 3～5 mL를 가하여 중첩시킨다. 이 경우 검체를 취하여 배지를 가할 때까지의 시간은 20분 이상 경과하여서는 아니 된다. 응고 시킨 페트리접시는 뒤집어 35±1°C에서 48±2시간(시료에 따라서 30±1°C 또는 35±1°C에 서 72±3시간) 배양한다.(단, 규정된 배양시간 전 일지라도 규격을 초과하는 집락이 계수되어 부적합 판정이 예상되는 경우 배양시간을 단축하여 판정할 수 있다.)집락수의 계산은 확산집 락이 없고 1개의 평판당 15∼300개의 집락을 생성한 평판을 택하여 집락수를 계산하는 것을 원칙으로 한다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 1 mL를 대조시험액으로 하여 시험조 작의 무균여부를 확인한다.
(여기까지가 식품공전에서 나오는 설명입니다! 쉽게 설명해 볼게요!)
1. 시험용액 1 mL(100)을 페트리디쉬2매 이상 무균적으로 취함
샘플에 따라 10배(10의 1제곱1 제곱), 100배(10의 2 제곱)로 희석하여 1 mL을 페트리디쉬2매 이상 무균적으로 취함
2. 멸균이 완료된 PCA를 43~45℃로 식힌 다음 약 15 mL를 분주 후 회전하여 응고
(확산집락 발생을 억제하기 위해 다시 PCA를 중첩(PCA 3~5 mL 사용)- 20분 이내로 완료하기.
3. 두 가지의 공배지로 시험조작의 무균여부를 확인
☆희석액(멸균생리식염수) 1mL 분주한 배지
★아무것도 넣지 않은 배지 (PCA를 페트리디쉬에 생으로 부어서 굳히면 돼요!)
나. 건조필름법
1) 시험조작 4.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 각 10배 단계 희석액 1 mL를 세균수 건조필름배지에 각 2매 이상씩 접종한 후 잘 흡수시키고 35±1°C에서 48±2시간 배양한 후 생성된 붉은 집락수를 계산하고 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 일반세균수로 한다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 1 mL를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 균수 산출 및 기재보고는 4.5.1 일반세균수에 따라 한다.
필름 2매 이상 준비 (네이밍 하기)
10배(101), 100배(102) 희석액 1 mL을 AC 필름2매 이상 균주.
35±"1"℃에서 48±2 시간 동안 배양
-배양 시 필름이 20장 이하로 적재될 수 있도록 배양
-판독범위: 300 CFU 이하
필름사용 방법 (일반세균수 필름=AC필름)
▶네이밍 ▶1번 방향으로 살짝 필름을 들어준다.
▶ 2번 방향으로 필름을 올린다.
▶ 중앙보다 살짝 높은 위치에 균주한다. (기포가 생기지 않도록 주의)
▶균주액이 밑으로 흘러 내리지 않을 정도의 속도로 필름을 덮는다.
▶ 엄지손가락에 힘을 살짝 주어 누른다. (누름판은 오목한 부분)
3M사 사용(AC필름)
판독방법
일반세균 배지 확인 방법
일반세균 필름확인 방법
▶콜로니형상은 흰색을 띠며테두리의 경계선이 뚜렷함 ▶ PCA Pouring 후 인큐베이터에 넣기 전 굳은 상태에서도 확인 가능한 흰점은 콜로니로 계수 하지 않음 ( 과자 가루, 원료, 지방 등 샘플의 특성에서 기인함.)
▶ 빨간 점을 띤다. ▶필름을 20장 이상 쌓아 배양하지 않음
★ 콜로니 2개
☆ 카운팅 귀찮...
평판배지는 콜로니를 각각 배지에서 구한다. 만일 5개 배지에 각각 (1,3,5,0,2) 이렇게 나온다면
보통은 평균 세균수를 계산하여 기준과 비교.
단위는 일반적으로 CFU/plate (콜로니 수) 또는 CFU/mL, CFU/g 등으로 환산.
